Pruebas para el diagnóstico de HIV - Conceptos básicos

Introducción

El Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, es una enfermedad infecciosa crónica causada por el virus HIV y cofactores asociados, caracterizada por presentar una deficiencia inmunológica progresiva, irreversible con la expresión clínica de infecciones oportunistas y/o tumores. En la República Argentina se utiliza la clasificación elaborada por el Centro de Control de Enfermedades Infecciosas de los Estados Unidos (CDC), la cual se basa en la evidencia de la infección por el HIV en le laboratorio y/o la presencia de enfermedades indicativas de SIDA (infecciones oportunistas, neoplásias, síndrome de desgaste o encefalopatía por HIV) diagnosticadas por métodos fiables o presuntivos.

El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) fue aislado e identificado como el agente etiológico de SIDA en 1983. Se conoce la existencia de dos serotipos del HIV, el HIV-1 y HIV-2. La mayoría de las infecciones en el mundo ocurren por el subtipo 1. La prevalencia del HIV-2 se concentra en África occidental. En la actualidad por las evaluaciones epidemiológicas y de laboratorio indican que tanto el HIV-1 como el HIV-2 se originaron en África central.



1. Indicaciones para el análisis de HIV

No todos los individuos deben realizarse la prueba para HIV, sino que debemos tener en cuenta las personas de riesgo, condiciones clínicas de la infección y estimar la proporción de infecciones en la comunidad para orientar apropiadamente a aquellos que más lo necesiten. El análisis realizado a personas que no están en riesgo de adquirir la infección disminuye el valor predictivo de una prueba positiva y es muy costoso para los programas de Salud Pública.

Las personas en riesgo de adquirir la infección por HIV incluyen, hombres con hábitos homo ó bisexuales; usuarios actuales ó anteriores de drogas por vía endovenosa; varones o mujeres dedicados a la prostitución; personas que mantienen contacto sexual con individuos infectados; hemofílicos que hallan recibido factores de coagulación antes de 1985; hijos de madres con riesgo de infección por HIV; personas que forman parte del equipo de salud y que tienen contacto con personas infectadas por ej. bioquímicos, médicos, enfermeros, extraccionistas, etc.. La orientación y análisis deberá ser recomendado a los individuos que admitan conductas riesgosas ó aquellas a las que les fue detectado un posible riesgo de estar infectadas.

El análisis para HIV es una herramienta útil para estudiar a pacientes con evidencias clínicas ó de laboratorio de infección por HIV y es una práctica necesaria antes de comenzar con la terapéutica. En muchos casos son frecuentes manifestaciones clínicas que nos llevan a pensar en una posible infección como por ej. Tuberculosis, la cual se agregó en 1993 como definición de SIDA, es por ello que toda persona con Tuberculosis pulmonar deberá ser orientada y analizada para HIV.

El análisis de HIV es particularmente importante para aquellas personas con algunas Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS) porque: practican conductas que pueden transmitir o recibir HIV y la presencia de alguna ETS facilitan la entrada del HIV.

La inyección de drogas por vía endovenosa, con el intercambio de jeringas y otros accesorios, colocan a las personas en una situación altamente riesgosa de transmisión para HIV.

Mujeres en edad reproductiva que están o han estado en una situación de riesgo para la infección deberán ser orientadas y analizadas; esto incluye uso de drogas, prostitutas, que hayan recibido transfusiones en 1978-1989, ó tuvieron relaciones con personas infectadas o de riesgo.

De todas maneras la indicación para realizar la prueba debe ser sugerida por el médico y siempre debe realizarse con el consentimiento del paciente.



2. Diagnóstico del HIV-1 en adultos

Existen diferentes pruebas de laboratorio para el correcto diagnóstico de la infección por HIV-1 en adultos. Para la selección de algunas de ellas debemos tener en cuenta criterios tales como sensibilidad, especificidad y valor predictivo. La sensibilidad significa que un test detecta la menor cantidad posible de antígeno o anticuerpo, es decir que se minimiza la posibilidad de obtener resultados falsos negativos, aunque es mayor la probabilidad de obtener falsos positivos. La especificidad se refiere a la capacidad que tiene la prueba seleccionada en detectar otro anticuerpo distinto al buscado, es decir que es menos la posibilidad de falsos positivos, pero es mayor la cantidad de falsos negativos. El valor predictivo es la probabilidad de identificar correctamente la presencia o ausencia de infección.

Existen más de 100 pruebas de laboratorio para la detección de anticuerpos anti-HIV-1, y debemos aclarar que todas diagnostican infección por HIV-1 y no SIDA. Existen dos niveles de pruebas serológicas:

- NIVEL I : Pruebas de screening o tamizado

- NIVEL II : Pruebas suplementarias o confirmatorias



2.1 NIVEL I : Pruebas de screening o tamizado

Las pruebas encasilladas en esta categoría en general son muy sensibles y reproducibles, por lo tanto tenemos casi la plena seguridad de los resultados negativos. No existe un test superior a otro y cada laboratorio debe seleccionarlo de acuerdo a sus necesidades, y siempre deben estar aprobados por los organismos de control de calidad.

En la actualidad se sabe que existen dos virus que producen SIDA, HIV-1 y HIV-2, aunque la distribución geográfica del segundo es limitada se lo aisló en distintos lugares del mundo. Por lo tanto, la mayoría de las kits comerciales detectan la presencia de ambos virus.

Las primeras pruebas en aplicarse para la detección de anti-HIV fueron los enzimoinmunoanálisis (ELISA). Son los más utilizados por su facilidad de uso, se prestan para analizar gran cantidad de muestras ya que son automatizables, y no requieren uso de material radioactivo.

Existen otras técnicas tales como la aglutinación de partículas de látex, de gelatina y hematíes y el Dot-Blot. Son más sencillas que el ELISA, más rápidas, no requieren instrumentos de medida y son ideales para laboratorios con muy baja cantidad de muestras.

Las primeras pruebas utilizadas y muchas de las que aún se utilizan, usan como antígeno lisados de partículas virales y se las conoce como de 1ra. Generación. Con el advenimiento de la Biología Molecular se pudieron sintetizar antígenos recombinantes y/o péptidos sintéticos, haciendo de esta manera las técnicas más sensibles y específicas (2da y 3ra Generación).

En forma resumida nos referiremos a las técnicas más utilizadas.

ELISA

Es el método más difundido, su uso fue aprobado en 1985 para los servicios de Hemoterapia o Bancos de Sangre. Tiene una sensibilidad y especificidad promedio del 99.5% y 99.8%, respectivamente. Se puede trabajar con distintos fluidos corporales (suero, plasma, LCR, etc.).

El principio básico de la reacción consiste; en la mezcla del suero del paciente con un antígeno (lisado viral,recombinate o sintético) que está unido a un soporte sólido. Si el anticuerpo está presente se produce la unión antígeno-anticuerpo, luego se agrega un conjugado que son anticuerpos dirigidos contra anticuerpos humanos o antígeno HIV, los cuales están unidos a una enzima. Estas enzimas son capaces de modificar al sustrato en presencia de un cromógeno produciendo un producto coloreado que es detectado visualmente o por un espectrofotómetro.

Existen en el mercado distintos tipos de ELISA:

- Indirecto: El suero del paciente se agrega a una fase sólida que contiene el antígeno y luego se agrega el conjugado y el sustrato. La intensidad de color será proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en la muestra; en el caso de que no existiera el anticuerpo no se producirá reacción de color.

- Competitivo: Este tipo de prueba se basa en que se agregan al mismo tiempo la muestra del paciente y el anticuerpo anti-HIV conjugado, los cuales compiten con el antígeno que esta presente en una fase sólida. El anticuerpo que se encuentre en mayor concentración desplazará al otro por los sitios de unión, luego se le adiciona el sustrato y se produce la reacción de color. En este caso la intensidad de color será inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en el suero del paciente, es decir que la presencia de color indica ausencia de anticuerpos en la muestra.

- De captura de antígeno: puede ser indirecto o competitivo, difiere en la etapa inicial de fijación del antígeno en la fase sólida. Un anticuerpo monoclonal se encuentra pegado a la fase sólida, el cual captura el antígeno agregado posteriormente. Esto tiende a disminuir la cantidad de sustancias contaminantes que se unen a la fase sólida, reduciendo de esta manera las uniones inespecíficas. Luego se agrega el suero en estudio el cual se une al antígeno y por ultimo se adiciona el conjugado y el sustrato. La concentración de anticuerpos presentes será proporcional a la intensidad de color. Esta pruebas son consideradas más específicas que las indirectas.

- De captura de anticuerpos: difiere del anterior que en la fase sólida tiene pegado anticuerpos dirigidos contra las inmunoglobulinas humanas (IgG, IgA o IgM). De esta forma podemos diagnosticar infección aguda cuando el anticuerpo encontrado es IgM.

- Con antígeno sandwich : Difiere del indirecto que en este caso el conjugado es un antígeno unido a un cromógeno.

AGLUTINACION

Son pruebas que en general tienen buena sensibilidad, aunque su especificidad en algunos casos fue cuestionada. Estos ensayos incorporan agentes portadores que son partículas utilizadas para transportar el antígeno, los más comúnmente utilizados son: hematíes (hemoaglutinación), partículas de latex (poliestirene), de gelatina o microesferas. Estas partículas están en suspensión y recubiertas (sensibilizadas) con el o los antígenos del HIV (recombinantes y/o sintéticos).

Los que se utilizan habitualmente son las partículas de gelatina, las cuales aglutinan en presencia de de los anticuerpos presentes en la muestra del paciente, formando una red a medida que se produce la reacción antígeno-anticuerpo, visualizandose de esta manera la aglutinación. Son técnicas simples, rápidas y reproducibles, cuya lectura se realiza macroscópicamente o a través de una lupa.

DOT BLOT O INMUNOBLOT

Es un ELISA rápido que utiliza como soporte sólido papel de nitrocelulosa. El antígeno (recombinante o sintético), en general se adsorbe pasivamente (blotting) al soporte en forma de gota (dot).

Actualmente existe otro ensayo el cual utiliza micropartículas recubiertas de antígeno que son atrapadas dentro de la membrana. Estas micropartículas son microscópicas y muy eficientes para transportar grandes cantidades de antígeno; la reacción ocurre en las micropartículas que luego se colectan en el papel para visualizar la reacción coloreada.

Otro ensayo es el inmunocomb, que es un ELISA en fase sólida, que usa como soporte un peine, en donde se encuentra el antígeno HIV-1 y/o HIV-2.

Las pruebas de dot-blot son fáciles de realizar, rápidas, la mayoría arroja resultados en pocos minutos , pero son muy costosas. En general se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una enzima que se fijan al anticuerpo del paciente. La adición de sustrato permite la visualización del color en el papel.

Otro ensayo utiliza como sustrato de color oro coloidal que se conjuga a una sustancia llamada proteína A. Esta proteína tiene la capacidad de unirse a la inmunoglobulina humana (anticuerpo del paciente), si la reacción es positiva se visualiza macroscópicamente como un círculo coloreado. Son útiles para bancos de sangre, salas de autopsias, servicios de transplantes de órganos, aunque no se debe utilizar como única prueba de screening y no son útiles cuando se trata de un gran número de muestras.



2.2 NIVEL II: Pruebas confirmatorias o suplementarias

En esta etapa se deben confirmar los resultados positivos de las pruebas de screening debido a que estas no poseen un alto grado de especificidad y pueden dar resultados falsos positivos. En general ante un resultado positivo por alguna de las pruebas del Nivel I, se repite en otra muestra por otro método distinto al utilizado y si la positividad persiste se realiza una prueba confirmatoria. De todas maneras no siempre se logran resultados concluyentes y se deben realizar pruebas adicionales para arribar a una conclusión definitiva.

Describiremos básicamente las más utilizadas:

WESTERN BLOT (WB)

Es en la actualidad la más aceptada. Fue desarrollada hace muchos años y se la reconoce como una técnica muy específica para detectar anticuerpos de muchos agentes infecciosos. Su especificidad es alta debido a la separación y concentración de antígenos virales. Es un ensayo cualitativo, utilizado in vitro para la detección de anticuerpos anti-HIV en suero o plasma.

La prueba se basa en que, un lisado de proteínas virales (previamente inactivadas) se separan de acuerdo a su tamaño por electroforesis en un gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-Page). El SDS es un detergente que desnaturaliza las proteínas virales y las carga negativamente, de esta manera migran en el gel por su peso molecular e independientemente de su carga. Las partículas más pequeñas migran hacia el ánodo (polo positivo) y las más pesadas se quedan cerca del cátodo (punto de siembra-polo negativo), de esta manera las proteínas virales se separan en bandas específicas de alta pureza. Luego se las transfiere eléctricamente a una membrana de nitrocelulosa respetando las posiciones originales de las bandas; la membrana es lavada y bloqueada para disminuir las uniones inespecíficas y por último se corta en tiras en las que se va a realizar el ensayo. Una vez terminado el proceso se observan las siguientes proteínas y glicoproteínas que desde el punto de siembra son: gp160, gp120, p65, p55, p51, gp41, p31, p24, p17 y p15 (los números indican peso molecular en Kilodaltons).

Por último las tiras se incuban con la muestra del paciente, siguiendo una técnica similar a un ELISA convencional. Se le agrega una inmunoglobulina anti-humana (anti-IgG) conjugada con una enzima que en presencia de un sustrato se produce la formación de bandas coloreadas en la tira de reacción.

La mayoría de los WB utilizados son fabricados comercialmente en forma de Kits, son sumamente sencillos y solo debemos agregar la muestra a analizar.

Una muestra es positiva para anticuerpos anti-HIV-1 si por lo menos se encuentran dos de las siguientes bandas: p24, gp41 y go120/160 (según normas de CDC).

Un resultado negativo es cuando no se observan bandas. Más de un 15% de individuos no infectados y que son negativos para las pruebas de screening pueden mostrar reactividad a uno o más antígenos; posiblemente debido a la presencia de anticuerpos, no específicos para HIV, que reaccionen cruzadamente. El valor predictivo (VP) de esta prueba usada como único método y en especial en grupos de baja seroprevalencia es del 28.6%. Pero cuando se utiliza junto con alguna prueba de screening, el VP aumenta al 99.5%.

Los resultados deben informarse como negativos, positivos o indeterminados.

Si una muestra resulta como indeterminada, no indica que el individuo este infectado, quiere decir que no cumple con los criterios establecidos para definirla como positiva o negativa. El patrón más frecuentemente observado es la presencia de las bandas p17, p24 o p55 o cualquier combinación de las tres proteínas, estos patrones generalmente se observan en pacientes en el momento de la seroconversión. En estos casos la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda: que se realice una nueva muestra a las dos semanas y si a lo largo de seis meses resultan ser negativos o no muestren incremento en la reactividad, la infección se descarta. Si en cambio el resultado es positivo, quiere decir que el paciente se encontraba en el periodo de seroconversión.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

La IFI para HIV se desarrollo a fines de la década del 80. Se emplea en muchos laboratorios como prueba confirmatoria, ya que es relativamente simple, más económica y consume menos tiempo que el WB, pero requiere un microscópio de fluorescencia y personal debidamente entrenado para interpretar los resultados.

El ensayo se basa en enfrentar la muestra con líneas celulares infectadas, las cuales se encuentran improntadas en un vidrio. Como control de inespecificidad se utiliza células no infectadas, en general en un mismo pocillo de reacción, se realiza una mezcla de 75% de linfocitos infectados (H9) y 25% de no infectados (H9 IIIB). La reacción antígeno-anticuerpo se visualiza con el agregado de una anti-inmunoglobulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína, produciendose una emisión de luz la cual se observa en un microscópio de epifluorescencia. Un resultado positivo (fluorescencia verde dentro de la célula), indica la presencia de anticuerpos par HIV-1. Algunas enfermedades autoinmunes pueden dar falsos positivos. Toda muestra negativa o inespecífica debe confirmarse por WB.

INMUNOENSAYO LINEAL (LIA)

Son inmunoensayos desarrollados en la década del 90, similares al WB. Se usan proteínas virales recombinanres y/o sintéticas, las cuales se aplican a un soporte de nitrocelulosa (en forma pasiva). Sólo poseen los siguientes antígenos virales gp41, p31, p24 y p17. Incorpora, además, un péptido sintético (gp36) específico para HIV-2, de esta manera podemos analizar en la misma muestra los dos virus. El principio de la técnica es el de un ELISA indirecto para la detección de anticuerpos específicos.

La reactividad de la prueba se compara con controles, determinandose un score por cruces.

RADIOINMUNOPRECIPITACION (RIPA)

Es una técnica de investigación, que requiere el uso de material radioactivo por lo que esta limitada a ciertos laboratorios. Es muy sensible y específica.

El principio de la técnica se basa en la utilización de un aminoácido marcado (cisteína), el cual se incorpora en un medio de cultivo de células infectadas por HIV. A medida que el virus replica incorpora en sus proteínas el aminoácido marcado. Luego las células se lisan y se solubilizan para luego agregar la muestra del paciente. Los inmunocomplejos formados se precipitan y se realiza una corrida electroforética en un gel de poliacrilamida, para luego visualizarlos a través de una autoradiografía. Detecta proteínas de envoltura gp160 y gp120, siendo una técnica sensible ya que detecta pequeñas cantidades de anticuerpo y específica por que estas proteínas están presentes en casi todos los infectados después de la seroconversión.

Pruebas en sangre y orina

La saliva y la orina son fluídos biológicos que tienen como ventaja su facilidad de obtención y que no requieren métodos invasivos. Se sabe de hace tiempo que existen anticuerpos presentes en saliva, pero las pruebas para detectarlo no fueron adoptadas como rutina a causa de su baja sensibilidad, pero con el advenimiento del ELISA la sensibilidad ha mejorado. Para el caso de la orina, estudios recientes indican que los anticuerpos detectados corresponden a IgG intactas y no solo fragmentos. En general en ambos ensayos sólo se detectan el 92% de las infecciones verdaderas.

Muchas compañías están tratando de desarrollar estas pruebas y puede ser que en poco tiempo sean empleadas como de rutina.

Algorritmo de las pruebas

Es el orden de las sucesivas etapas que deben seguirse en el procedimiento diagnóstico y contemplan en general los niveles de screening y de confirmación. Es importante que tengamos en cuenta lo siguientes criterios: finalidad del estudio, sensibilidad y especificidad de la prueba que se emplea y prevalencia de la población en estudio.

Las pruebas de detección deben repetirse por duplicado en todas las muestras reactivas iniciales. Con esta medida nos aseguramos de los errores técnicos (por ej. errores de manipulación).

Todos los resultados repetidamente reactivos en la pruebas de screening deben ser confirmados por una prueba de confirmación aceptada.

La algorritmia más comúnmente utilizada para el diagnóstico de la infección por HIV es utilizar el ELISA, si es positivo repetidas veces, realizar un 2do ELISA ó método rápido basado en una preparación del antígeno utilizado. Los individuos positivos para el 1er ensayo y negativo para el segundo deben ser considerados negativos. Si ambas metodologías son positivas deben analizarse por un método de confirmación tales como WB; si este es negativo el paciente es negativo y si es indeterminado la muestra debe repetirse a las dos semanas y continuar con el estudio por seis meses (OMS).



2.3 Pruebas suplementarias

Se indican en ocasiones especiales cuando los métodos descriptos anteriormente no resuelven un diagnóstico en forma definitiva. Deben realizarse cuando:

- personas seronegativas que tuvieron contacto con seropositivos o que hayan estado en contacto con material contaminado (por ej. punciones percutáneas y/o contacto de las membranas mucosas ó piel dañadas de alguna manera).

- casos indeterminados.

- evaluación de la enfermedad y/o tratamiento.

- confirmación de la infección en niños nacidos de madres HIV seropositivas.

Las pruebas más habitualmente usadas son las que a continuación describiremos.



Detección de Antígeno p24

Es una prueba que en principio fue concebida para detectar la producción de p24 en sobrenadantes de cultivos.

Es de vital importancia entender en que momento se produce la antigenemia en un paciente infectado, para no realizar pruebas innecesariamente.

El período de infección primaria en general abarca un total de 4-8 semanas, se los puede dividir en dos etapas: la primera de diseminación que abarca la primeras 2-3 semanas y culmina con el pico de viremia y la segunda consiste en la producción de anticuerpo específico junto con una adecuada respuesta inmune para tratar de eliminar el virus.

El procedimiento es semejante a la detección de anticuerpo, basado en un ELISA tipo "sandwich"; la diferencia radica en que en vez de fijar un antígeno HIV a la fase sólida se fija un anticuerpo anti-HIV, y luego el antígeno p24 presente en la muestra es capturado. Luego se agrega un conjugado que es un anti-HIV conjugado con una enzima, para luego agregar el sustrato y producir la reacción de color, la intensidad del mismo es proporcional a la cantidad de antígeno presente.

De todas maneras una reacción positiva debe confirmarse y el significado de la presencia de antígenos virales en sangre u otros fluídos biológicos aún no ha sido establecida definitivamente y debe ser evaluada dentro de un contexto junto con otros marcadores.

Existen diferentes métodos de confirmación:

- por neutralización: se basa en la reacción de ELISA, sembrando cada muestra por duplicado, en donde en uno de los pocillos se le agregan anticuerpos contra p24en exceso, estos actúan como bloqueantes de tal forma que la positividad de la reacción se confirma con una disminución de la reactividad de la muestra. En el caso de la detección de antígeno p24 la sensibilidad puede estar disminuída por la formación de inmunocomplejos in vivo; es probable que estos complejos antígeno-anticuerpo se formen durante la seroconversión. Es por ello que se desarrollaron técnicas de disociación e complejos.

- disociación ácida: se basa en la adición de un ácido a la muestra durante un periodo estipulado de tiempo, y luego se realiza la técnica habitual de ELISA. Otra forma es precipitar los inmunocomplejos seguido de un tratamiento ácido. Se han ensayado diferentes variantes con resultados aceptables.

- disociación alcalina: a diferencia del anterior se le agrega un álcali en ves de un ácido, los resultados son semejantes. De todas maneras un resultado positivo debe ser confirmado por neutralización



Cultivo viral

No es una técnica habitual para los laboratorios de rutina, ya que requieren de equipamientos y niveles de seguridad con normas establecidas por la OMS y además contar con personal adiestrado para el aislamiento y manipulación de muestras virales.

Es una técnica altamente sensible y específica, pero es muy costosa, laboriosa y potencialmente peligrosa.

La principal fuente de virus son las células mononucleares presentes en sangre periférica, ya que el virus preferentemente replica en las células que expresan en su superficie la molécula CD4.

La técnica se basa básicamente en enfrentar células mononucleares del paciente con leucocitos de un banco de sangre, en presencia de un estimulante como IL-2 (estimula y prolifera los linfocitos CD4+). Semanalmente se recogen los sobrenadantes del cultivo y se determinada la producción de antígeno p24, actividad de transcriptasa reversa o inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales. Un cultivo se considera positivo cuando en algunos de los sobrenadantes de cultivo diera positivo para algunas de las determinaciones antes citadas; es negativo cuando al cabo de 28-30 días todas las muestras dieron negativas. Un resultado negativo no descarta infección , ya que pueden ocurrir falsos negativos.



Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El genoma del virus HIV es un ARN, el cual cuando penetra a la célula se desprende de su cápsula protéica y a través de la enzima transcriptasa reversa se transforma en ADN, el cual penetra en el núcleo y se integra con el genoma de la célula huesped, formando así el provirus. Una vez integrado el ADN viral es copiado para generar múltiples copias de ARN que darán origen a las proteínas virales y a nuevos genomas de ARN.

La PCR, es una técnica de amplificación genética ampliamente difundida en medicina y biología molecular. Se desarrollo en 1985 y uno de sus principales campos de amplificación es el diagnóstico de infección por HIV en pediatría. Se utiliza para detectar ácido nucleico viral después de la amplificación del ARN o ADN viral. Es una técnica extremadamente sensible por que nos permite detectar una sola copia de ADN proviral, presente en una muestra. La PCR puede detectar infección antes que a produccción de anticuerpos y a veces antes que el cultivo viral.

El proceso consta de una etapa de amplificación en la cual a través de oligonucleótidos sintéticos (secuencias de ácido nucleico del HIV conocidas como iniciadores) se produce la detección de una zona específica del HIV, para luego sintetizar cadenas de ADN. Este proceso se realiza en presencia de una enzima llamada Taq-polimerasa y que por medio de un Termociclador se producen la síntesis de millones de copias de ADN. Los productos de PCR pueden ser detectados utilizando una sonda marcada con enzimas, radioisótopos, señales químico luminosas o a través de un gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio.

Es muy utilizada para: diagnosticar primo infección por el HIV-1 (período ventana), resolución de la infección en casos indeterminados, vigilar terapia antiretroviral, diagnosticar infección por HIV en niños y diferenciar infección por HIV-1 y HIV-2 diferenciación de subtipos.

No es una técnica de confirmación, ya que un resultado negativo no descarta infección y un resultado positivo no indica infección ya que al ser un técnica muy sensible puede existir contaminación con muestras positivas.



3. DIAGNOSTICO DE INFECCIÓN POR HIV EN PEDIATRIA

La transmisión del virus de HIV de la madre al niño constituye la principal causa de SIDA en pediatría. Aproximadamente el 25% de los niño nacidos de madres seropositivas, nacen infectados. Actualmente con el tratamiento preventivo con zidovudina (protocolo 076) como profilaxis preventiva a mujeres embarazadas HIV-1 positivas desde la semana 14, seguido por un refuerzo endovenoso durante el parto, y al niño durante las 6 primeras semanas de vida, se logra reducir la transmisión vertical a un 8%.

Cuando se produce la infección en los niños es tema de una amplia discusión en el mundo, y se sabe que puede ocurrir en tres momentos diferentes: intraútero, durante el parto o a través de la leche materna, este último caso en la actualidad ya no se produce ya que se le impide el amamtamiento a toda madre HIV positiva.

La detección de la infección por HIV en pediatría es de vital importancia ya que el médico puede instaurar en forma temprana un terapéutica adecuada. En los adultos el criterio de infección se basa en la detección de anticuerpos del tipo IgG. En niños menores de 18 meses

esta no puede ser utilizada ya que los anticuerpos del tipo IgG de la madre infectada pueden atravesar placenta , y de esta manera un resultado positivo por las técnicas antes mencionadas no indica una infección por HIV. Esta persistencia de los anticuerpos maternos se explicaría por los altos títulos observados y la larga vida media de los mismos (28 días). Es por lo antes mencionado que el diagnóstico de infección por HIV-1 en pediatría debe realizarce por otros métodos alternativos, a los cuales los mencionaremos sintéticamente.



3.1 Detección de Anticuerpos

Como comentamos anteriormente la presencia de anticuerpos de tipo IgG no significa diagnóstico de infección, su ausencia tampoco la descarta.

Los motivos por los cuales existe un retraso en la producción de anticuerpos en los niños responden a distintas causas:

- inmadurez del sistema inmunológico

- deterioro de la función de los linfocitos B (responsables de la producción de anticuerpos)

- la cantidad de antígeno viral es tan importante que la formación de inmunocomplejos impide la detección de los anticuerpos

De todas maneras puede ser útil, aunque costoso, el seguimiento del paciente con un mismo ELISA y observar si a lo largo del tiempo se produce un incremento de los valores de densidades ópticas y/o aparición de nuevas bandas en el WB.

La búsqueda de otros anticuerpos, producidos tempranamente en la respuesta inmune y que no atraviesan la placenta (IgM, IgA), obtenidos por remoción de IgG serían de utilidad para diagnosticar infección por HIV.

Ninguna de las técnicas actualmente disponibles (algunas todavía en etapa de investigación) para detectar anticuerpos de cualquier tipo (IgG, IgM e IgA) es lo suficientemente adecuada para un correcto diagnóstico. De hecho el CDC (Centers for Disease Control) no lo incluye en el algoritmo diagnóstico para la infección por HIV en pediatría.

De todas maneras las técnicas utilizadas para los adultos también pueden ser utilizadas para los niños mayores de 18 meses.



3.2 Detección de virus y métodos moleculares

Estos métodos son utilizados cuando el niño a estudiar tiene una edad inferior a los 18 meses y habitualmente son recién nacidos, para de esta manera poder realizar el diagnóstico tempranamente.

Son técnicas que nos permiten detectar la presencia del HIV; tales como antígeno p24, cultivo viral y PCR. Estas metodologías ya fueron descriptas en la parte de pruebas suplementarias en el diagnóstico del HIV-1 en adultos (2.3)

La técnica de antígeno p24 es probablemente la de menos utilidad por su baja sensibilidad, la cual es del 90% a los 6 meses de vida.

La PCR es un método altamente sensible que nos permite amplificar por lo menos 1 copia de ADN proviral. Pero cualquiera de las técnicas de PCR que utilicemos, resulta conveniente realizar la misma, al menos para dos de los genes que codifican para distintos componentes virales (gag, pol y env), ya que podrían existir resultados discordantes.

El cultivo viral y la PCR son las técnicas más utilizadas, permitiendo detectar entre el 30-50% de los neonatos al nacer, y entre el 80-100% dentro del primer mes de vida.



3.3 Criterios diagnósticos

A- Niños menores de 18 meses, hijos de madres HIV positivas: resultados positivos en dos determinaciones separadas (excluyendo sangre de cordon), de una o más de las siguientes pruebas: Cultivo de HIV, PCR o antígeno p24. Cuando se pueden realizar cultivo viral y PCR, para por lo menos dos genes; un resultado positivo por ambos métodos y en una sola muestra, es diagnóstico de infección por HIV. En un trabajo publicado por nosotros pudimos establecer que si se realiza PCR para dos genes (por ej. gag y env) en dos muestras diferentes y ambos dan positivos podemos concluir que el niños esta infectado, logrando una sensibilidad del casi el 100%.

B- Niños mayores de 18 meses, nacidos de madre HIV positivas o infectados por otro medio de contagio (hemoderivados, contacto sexual, etc.): anticuerpos anti-HIV repetidamente positivos por ELISA y confirmados por test confirmatorio (por ej. WB), o reúna algunas de los criterios del punto A

Fuente: www.sida.bioetica.org

4 comentarios - Pruebas para el diagnóstico de HIV - Conceptos básicos

@EduardoS
me dio flojera leer...
@Ubuntero
Hay que resumir muchachos!!
@lenny321
La pruba que tiene una efectividad del 99.9% es WESTERN BLOT, por si alguien tiene

la duda de que tiene el bello animalito que a matado 250000mil millones de personas

en todo el mundo, os invito a usar el profilactico "condon".
@llkdie
esto se puede hacer en casa?